明嘉靖十四年（1535），廣州市舶提舉司舶口遷至澳門，澳門自此成為一個朝廷派有官員管理的對外口岸，走出開埠的第一步。
在歐亞大陸另一端，葡萄牙自15世紀初開始海上擴張，逐步到達南非好望角，佔領果阿、馬六甲，並試圖與中國建立直接商貿聯繫。1513年（明正德八年），歐維治（Jorge Álvares）成功航行至珠江口的屯門，成為第一個抵達中國的葡萄牙人。但早期葡萄牙在華經貿並不順利，只能在廣州外海一帶暗中非法貿易，但交通不便，水土甚惡，開始頻密光顧澳門。據《澳門記略》稱︰“三十二（1553）年，蕃舶托言舟觸風濤，願借濠鏡地曝諸水漬貢物，海道副使汪柏許之。初僅茇舍，商人牟奸利者漸運瓴甓榱桷為屋，佛郎機遂得混入。高棟飛甍，櫛比相望，久之遂專為所據。蕃人之入居澳，自汪柏始。”
澳門開埠後，迅速成為東亞的貿易港口，一方面連接從歐洲至中國的貿易航線（里斯本—果阿—澳門），另一方面也連接與日本長崎的貿易。當葡萄牙入併西班牙時，從墨西哥至菲律賓到澳門的貿易航線也隨著開通。在15世紀末至16世紀初期，中國貨物如瓷器、茶葉和絲綢，經澳門出口至日本、東南亞、印度、非洲、歐洲及美洲；而明朝則從貿易中換取國內稀缺的白銀。
除了貿易之外，天主教傳教士也隨船來到遠東，向這片新天新地傳播福音。澳門開埠後不久，耶穌會最為熱衷於傳教工作，他們在城內建造聖安多尼堂、聖老楞佐堂和聖拉匝祿堂（望德聖母堂），並組織中國和日本傳教的工作。其後，方濟各會、道明會和奧斯定會亦紛紛在澳門立足。在1576年時，羅馬教廷頒令成立澳門教區，負責管理中國、日本、越南等地的事務，其範圍包含遠東和東南亞地區。在天主教傳入中國的過程中，耶穌會傳教士一方面把西方技術傳到中國，另一方面把中國的經典翻譯帶回歐洲。澳門不但是遠東的傳教中心，也在文化上擔當交流平台的角色。
隨著城市漸漸發展起來，居澳葡人在薩主教（D. Leonardo de Sá）的倡議和主持下，於1583年組織議事會。議事會獲葡萄牙國王認可，享有政治、司法和行政權，對澳門城內的葡萄牙人進行管理。不過，葡萄牙皇室在1623年派遣“澳門總督”，不僅能行使軍事權力，同時也獲授予一定的司法權和財政權，促使議事會和澳門總督的關係時常處於緊張狀態。另外，明朝仿傚“番坊”的模式對澳門城進行管理，由香山知縣與議事會進行聯絡，管理澳門的事務。同時，明朝也在1574年在“蓮花莖”上設立關閘，既是控制華夷的往來，也掌控澳門城的物資，使葡萄牙人服從於明朝。
踏入十七世紀，澳門的貿易地位吸引其他歐洲國家的爭奪，包括後起的荷蘭東印度公司。1622年，荷蘭東印度公司組織一支遠征軍，試圖從葡萄牙人手上奪取澳門城，但葡萄牙人卻成功抵禦荷蘭人的攻勢。然而，隨著荷蘭東印度公司在亞洲的擴張，他們漸漸取代葡萄牙人的勢力，加上清初的貿易政策，使澳門的貿易走向衰落。