十八世紀中葉，英國、法國、美國和瑞典等國家加入對華的貿易的隊伍中，在清朝的“一口通商”政策下，澳門遂成為各國外商“住冬”之地，並以此維持地方經濟。但由於葡萄牙人的勢力大不如前，英國人二度以保護澳門為由嘗試佔領（1801年及1808年），在清朝的威脅下被阻止。
此時期葡萄牙人的貿易已經大大衰落，轉而依靠進口鴉片到中國賺取利潤，英國、法國等國隨後參與，鴉片貿易水漲船高，澳門一度成為轉口中心。鴉片氾濫使清朝出現嚴重的經濟和社會問題，清廷決心打擊猖獗的鴉片貿易。1822年，欽差大臣林則徐到澳門禁煙，但鴉片貿易婁禁不止。隨著英國與清朝的貿易爭議白熱化，終於在1839年爆發“鴉片戰爭”；戰後兩國簽訂《南京條約》、香港開埠，澳門的貿易地位大受打擊，促使葡萄牙人計劃對澳門實施殖民化。
除了清廷與各國紛爭的影響之外，澳門的政治也出現較大變化。1783年，葡萄牙皇室發佈“王室制誥”，大大降低議事會的權力，並加強澳門總督的權限，議事會日益沒落。雖然議事會曾經多次嘗試向皇室請求恢復權力，但都未能成功，反而澳門總督的地位不斷加強。在1844年，葡萄牙下令成立“澳門、帝汶和索洛省”，把議事會置於澳門總督的管轄，澳門總督成為澳葡政府的領導。
另外，基督新教在十九世紀初期傳入澳門，並開始在中國展開傳教事業，其中馬禮遜牧師對中西文化交流上作出重要貢獻。