雷爾生（Cornelis Reijersz）按照巴達維亞總督科恩（Jan Pieterszoon Coen）的命令，率領八艘軍艦從巴達維亞起航前往澳門。在此之前，四艘軍艦在4月1日作為先遣艦隊已提前出發。科恩的目的是建立荷蘭東印度公司與中國的貿易，他讓艦隊決定是攻取澳門，還是另覓別處建立據點。

當雷爾生的艦隊緩慢地航行時，四艘軍艦突然出現在澳門海域。她們分別是兩艘荷蘭船及兩艘英國船，原本隸屬於封鎖馬尼拉的楊松（Willem Janszoon）艦隊，但他們提前到達澳門執行封鎖澳門的任務。儘管荷英艦隊的出現驚動澳門城，但在賈羅布（Lopo Sarmento de Carvalho）的指揮下，澳門守軍開始加強城市的防衛，防範着荷蘭人的入侵，同時也組織船隊護送往來澳門與馬尼拉的船隻。

荷蘭東印度公司的艦隊全部抵達澳門，一共有14艘軍艦（另外還有兩艘不參戰的英國軍艦）。雷爾生立即派遣三隊人在澳門四周偵察，其中一支奉命在半島東邊上岸找尋華人作對話，但未見有任何華人的蹤影。當葡萄牙人發現荷蘭人的偵察小艇後，曾經向小艇開火，但沒有對敵人造成任何傷亡。

雷爾生原本打算在抵達後翌日進攻澳門，但因下雨及船隊尚未就位而延後一天。下午2點，“格寧羅根號”和“勇敢號”駛近南灣，向加思欄炮台發炮。羅薩里奧（António do Rosário）形容“巨大的炮聲像令人恐佈的雷聲，瘋狂的炮彈像一道道閃電，密集得像驟雨一樣”，但“格寧羅根號”船長邦特科（Willem Ysbrantsz Bontekoe）稱這僅是一次試探的攻擊。加思欄的炮擊從下午一直到入夜。

晚上，澳門守軍聽到荷蘭人的艦隊傳出鼓聲和笛聲，認為是敵人舉行夜會，賈羅布命令士兵亦舉行夜會“還擊”，並且鼓勵守軍勇敢面對敵人。

晨曦時，荷蘭人向澳門發動全面進攻，他們一方面派“格寧羅根號”和“勇敢號”再次炮轟加思欄，另一方面派出600人從劏狗環海灘搶灘登岸。賈羅布早已預料荷蘭人在這處海灘登陸，於是修建一道沙土牆，並且派150人防衛海灘，但寡不敵眾，最終撤出海灘的防線。不過葡萄牙人猛烈的射擊，卻射傷了雷爾生，荷蘭軍隊轉由魯芬（Hans Ruffijin）負責。魯芬見葡萄牙人不堪一擊，立即命令部隊乘勝追擊，直取澳門城。

荷蘭軍隊一步步向澳門城進逼，儘管葡萄牙人零星地反擊，但仍然無法阻止大軍的步伐。當荷蘭人來到東望洋山腳的山泉處，他們遭到聖保祿炮台的炮擊，據說發炮的人是耶穌會士羅雅谷（Jeronimo Rho）。荷蘭人遭到炮擊後停下步伐，與澳門守軍在城外射擊，雙方處於膠着狀態。

雖然荷蘭人以人數優勢搶佔上峰，但魯芬過急行軍帶來的影響浮現，部隊登岸後未有補給彈藥，士兵們手上的火藥不夠。當火藥的補給送到前線時，一桶火藥突然發生爆炸，雖然沒有造成嚴重傷亡，但士兵無法及時補給彈藥，士氣漸漸崩潰。

與此同時，賈羅布看到荷蘭軍隊發生爆炸，認為這是反擊的好時機，於是命令向荷蘭人進攻，全員高喊“聖地牙哥”的戰號殺入敵陣。除了葡萄牙人，300名黑奴和耶穌會士也趕到前線，向荷蘭人發起衝鋒。荷蘭人受到澳門守軍的猛烈攻擊，開始落荒而逃。

荷蘭人的戰況失利後，魯芬命令部隊前往東望洋山搶佔高地，但當部隊抵達山上的聖堂時，卻遭到葡萄牙人的伏兵攻擊。荷蘭人的戰線徹底崩潰，人們紛紛逃往劏狗環海灘，登上小艇返回艦隊，但不少人在途中被葡萄牙人殺死，包括魯芬及多名隊長。荷蘭人在這場戰役損失了136人，且有126人嚴重受傷，還有七人被葡萄牙人俘虜。“澳門之役”後，荷蘭艦隊重整旗鼓，在6月29日離開澳門，北航至澎湖尋找新的據點。

澳門守軍大勝後，他們前往教堂舉行瞻禮，感謝上帝賜予勝利。由於這天是施洗者約翰（João Batista）的主保日，澳門市民把約翰奉為澳門城主保。黑奴也因英勇的戰鬥表現，不但在戰後獲得自由，也得到明朝官員給予大米作嘉許。“澳門之役”後，葡萄牙人在反擊荷蘭人的戰場上豎立石十字架作紀念的地標，其後在1871年豎立一座得勝紀念碑，而6月24日也設為“城市日”。時至今日，每年6月24日聖約翰節，澳門土生葡人團體在望德堂坊舉行慶祝活動，紀念幾個世紀前市民保護澳門的日子。