1611年（明萬曆三十九年），由9艘戰船組成的葡萄牙護航艦隊抵達澳門，中國官府要這支船隊照章交納船税。指揮這支艦隊的梅內澤斯（Dom Diogo de Vasconcelos de Menezes）卻以這些船隻為王家兵船為由，拒絕納税，並威脅中國官吏，必要時將以武力對抗。廣東官府下令封澳，斷絕對澳門的糧食供應，引起了當地葡萄牙人對梅內澤斯的不滿，他們抓住幾個船長，強迫船長向中國官府交税。梅內澤斯等繼續抗拒，市民集結到議事亭，要議事局出面解決。最後，由議事局為艦隊代交了4870兩銀子的船税才使風波平息。

1604年（明萬曆三十二年），曾隨利瑪竇（Matteo Ricci，1552－1610）到過北京、南京的天主教傳教士郭居靜回到澳門。1606年初，澳門傳出流言説，耶穌會士勾結葡萄牙人、荷蘭人和日本人，要殺在澳的中國人，然後用武力征服中國，並擁戴郭居靜為皇帝。這一謠言迅速傳遍全澳，使中國居民十分驚恐，紛紛返回內地，澳門僅剩下葡人及黑奴。兩廣總督戴耀聞知，亦很緊張，急忙下令調集軍隊，準備防禦；並斷絕與葡人的一切貿易，禁止將糧食運入澳門。澳門得不到糧食，很快就出現嚴重的糧荒，澳葡當局急忙派出一個“最謙恭”的代表團， 去向戴耀表白並無入侵之事。經過各方調查，並派人招見郭居靜和參觀全澳的教堂、旅店、醫院等，證實無戰事跡象。於是，緊張局面得到緩和，中外貿易也恢復了正常狀態。

明朝官員強行拆除澳葡當局在澳門非法修築城牆的案件。1623年（明天啟三年），澳葡當局沒有獲得明朝政府的允許，藉口防禦荷蘭的進攻，在水坑尾三巴門間，建築了一道城牆。城牆起於今西望洋山聖母堂附近，分東西兩翼延伸，東翼城牆循東面山坡一直到燒灰爐台止；西翼城牆，則分南北兩幅，南幅止於西望洋山聖母堂的西南山脊，北幅一直伸到媽閣廟的海鏡石。明朝政府對於葡人的這種越權非法行為採取了堅決的行動，廣東海道副使徐如珂首先通知澳葡當局拆毀這道城牆，澳葡不聽。徐如珂即派中軍領兵進駐澳門，自己也隨軍前往，並命令軍隊拆毀城牆。不到兩天，城牆全部拆毀，澳葡不敢反抗。原城牆下的媽閣斜巷等街道，後人俗稱為“萬里長城”。

1614年（明萬曆四十二年），兩廣總督張鳴崗根據海道副使俞安性的建議，為便於對居澳葡人進行管理，將澳門葡萄牙人聚居地方編街道號碼，定立門籍，逐項登記。做法是在葡人居住的大街上樹高柵，掛榜書“畏威懷德”4字。又以《尚書•旅獒》篇中“明王慎德，四夷咸賓，無有遠邇，畢獻方物，服食器用”20字，分別作為門號，分為東10號、西10號，防止奸人進入；同時還禁止葡人在居留地內私藏武器、彈藥，並由在澳門的中國官員對當地房屋進行認真搜查。

1574年（明萬曆二年），明朝政府在澳門半島與內地相連的沙堤——蓮花莖的中段（今關閘馬路中段），設置關閘一事，史稱“莖半設閘”。此座中式城樓形式的關閘，位於澳門與內地之間的險要處，扼內地通往澳門的陸上咽喉。開始時每5日開啟一次，設官兵把守，成為限制民夷出入之要隘。後逐漸成了一個重要關卡，至清代則由幾日開啟一次變成日日開啟的“官關”。1673年（清康熙十二年）改為“關閘汛營”，由前山派兵駐守。至道光年間（1821～1850）林則徐任欽差大臣時，關閘更由重兵鎮守。後來，關閘變成了邊界，不僅限制洋人出入境，更禁止居澳葡萄牙人擅自越過關閘到前山打鳥。1849年的關閘事件中，關閘城樓首次被葡兵佔領，延至1870年（清同治九年），澳葡當局竟將關閘城樓拆毀，夷為平地。蓮花莖古關閘存世近300年，只餘關閘城樓刻着“關閘門”3個字的匾額，迄今仍鑲嵌在民政總署大樓入口大堂的牆上作為古關閘的唯一證物，也成為殖民擴張的歷史見證。

1580年（明萬曆八年），居澳葡萄牙人擅自選舉首席法官，並在當地實施葡萄牙法律。1582年新任兩廣總督陳端奉朝廷之命，前來查辦這一事件。陳瑞先傳令澳葡地方長官，即中日貿易船隊司令米蘭達（Aires Gonsalves de Miranda）和薩（D. Leonardo de Sá）主教，前往兩廣總督駐地肇慶。澳葡派出與中國官員關係密切的司法官本涅拉（Mattia Penella）和傳教士羅明堅（Michele Ruggieri）作為代表去與總督周旋。在參見陳瑞時表示，居澳葡人無論是過去還是現在總是中國皇帝的順民，並承認兩廣總督殿下是他們的保護者，懇請總督對他們加以扶助及慈愛。接着又把隨身帶去的一批天鵝絨、水晶鏡等總值超過1000金幣的厚禮送給陳瑞。於是陳瑞便吿訴他們可以在澳門繼續居留，但必須服從中國官員的管轄。

朱印船即指1592年（明萬曆二十年）至1639年（明崇禎十二年）間持有幕府將軍朱紅印執照、可以從事海外貿易的日本商船。1608年11月30日， 一艘日本“朱印船”的船員在澳門的碼頭上與葡萄牙人發生糾紛，接着，他們上岸尋釁，打傷了前來勸解的澳葡官員。澳葡中日貿易船隊司令佩索阿（André Pessoa）和憤怒的士兵、市民一起進行反擊，殺死、俘獲近百名日本船員。1609年秋，消息傳到日本，日本政府決定懲罰正在長崎進行貿易的佩索阿。他們調集軍隊於1610年1月3日對佩索阿的船隊發動圍攻。戰鬥持續四日，直到1月6日晚，最後，佩索阿點燃船上的火藥庫將自己連同價值上百萬的金銀和近3000擔生絲全部炸沉海底，事件遂告平息。

蔡善繼，字伯達，浙江烏程人，明萬曆年間（1573-1620）任香山縣知縣。1608年（明萬曆三十六年），澳葡當局對一名首犯判刑，引起一部份葡人不服鬧事，澳門陷入混亂，無法控制局面。蔡善繼獲知此事後，“單車駛澳”，親自出面處理了這一宗案件，平息了騷亂。事後訂出了《制澳十則》，警告葡人不得在澳門置物業、蓋房屋；主張對澳門葡萄牙人嚴加管制，受到兩廣總督張鳴崗的採納。蔡善繼廉潔奉公，執法嚴明，使葡人無機可乘，在澳門葡人中享有很高的威信，其制澳事蹟亦在香山縣人民中廣為流傳。

17世紀初澳葡守軍擊敗荷蘭海軍進犯澳門的一場戰鬥。葡人來澳不久，荷蘭亦覬覦澳門。1601年（明萬曆二十九年），荷蘭數次向明政府提出借地通商的要求，均被拒絕。又於1601年和1604年兩次進攻澳門，均未成功。1622年（明天啟二年），荷蘭大舉侵澳，出動巴達維亞8艘戰艦，並聯合艦長苗活的4艘戰艦，配備巨炮60門，士兵1000人，由荷蘭提督賴啫臣（Kornelis Reyerszoon）統率，於6月10日出發，直奔澳門。6月21日，荷艦抵澳門海面。當時澳門守備力量僅50名火槍兵，100多名能執武器的土生葡人和三座配備不全的炮台。6月24日破曉，荷蘭軍艦猛轟嘉思欄炮台，炮台守軍全力回擊，當即擊毀一艘。賴啫臣即率800名精鋭部隊在劏狗環一帶登陸，葡軍憑藉新挖戰壕向荷軍反擊，賴啫臣腹部中彈返回，命盧芬（Hans Ruffijn）代他指揮。荷軍在盧芬上校的指揮下很快佔領龍環村、龍田村一線，被大龍泉、二龍泉匯合的坑水阻擋。葡方的伯多祿炮台發炮轟擊，命中荷軍火藥車，使荷軍死傷慘重。這時，澳葡中日貿易船隊司令薩門托（Lobo Sarmento de Carvalho）也親臨前線，並發出反攻命令，葡軍、市民、修道士及黑奴們一起出擊，特別是黑奴作戰勇敢，奮不顧身，當場擊斃盧芬，荷軍全面崩潰。是役，荷軍死136人，傷126人，其中11名校級軍官，死傷的日本人和印尼人也達數百人，還有一名上校及一批士兵被俘。葡方傷亡極輕。澳門葡軍獲得了完全的勝利。為了紀念這一空前大捷，澳葡當局將6月24日定為澳門城市日。

1564年（明嘉靖四十三年）4月，潮州柘林水兵因缺餉斷糧而嘩變，變兵隊伍在徐永泰等人率領下，聯絡其他一些武裝，進抵虎門附近的三門海，對兵力空虛的廣州構成嚴重威脅。為進一步打開中國大門，取悦於明朝政府，曾任濠鏡（澳門）葡萄牙人首領的佩雷拉（Diogo Pereira）派人前往廣州，向明將俞大猷表示，願意幫助明政府鎮壓兵變。獲得同意後，佩雷拉與中日貿易船隊司令德梅洛（Luiz de Mello）率領300名葡萄牙士兵參戰，分成兩隊，登上幾艘裝備有西式火炮的中國戰船，直駛三門海，以突然襲擊的戰術，很快擊敗叛兵。此役生擒變兵612人，斬首不計其數。

1644年（清順治元年），崇禎帝自盡，明王朝傾覆後，澳門葡萄牙人仍全力支持殘存的南明政權的抗清事業。1645年3月，耶穌會士畢方濟（François Sambias, 1582-1649）奉南明福王之命前往澳門求援，受到澳葡當局的隆重接待。由於福王政府旋即覆亡，畢方濟又向建立在福州的唐王政府表示忠誠，與信奉天主教的太監龐天壽一起去澳門購炮請兵。葡萄牙人予以積極的支持，給他們提供了一批大炮，還選派了300名士兵。唐王政府則同意將對面山下的一塊地方作為耶穌會士陸若漢的墓地，開始了葡人居留對面山的歷史。不久，唐王政府被清軍消滅，龐天壽就帶這支葡萄牙軍隊去投奔建在桂林的桂王政府。葡萄牙的軍事援助對於桂王政府的抗清起了很大的作用，多次擊退清軍，同時，耶穌會士也積極地在南明君主中傳播天主教，南明君主紛紛皈依天主，太后、皇后及太子均入教。1648年（南明永曆二年），久病的太子在受洗後恰好病愈，王太后還派龐天壽前往澳門，請求耶穌會的司鐸們舉行彌撒大祭。10月17日，龐天壽入澳，各炮台鳴炮致敬，修道士們列隊出迎。10月31日，聖保羅教堂為南明王室隆重地舉行彌撒，彌撒結束，澳門總督又設宴款待使者，還贈送火槍100支作為給桂王政府的禮物。桂王政府也因之答應永遠豁免每年500兩的地租銀，並豁免澳葡數年的船舶餉税。澳葡政府與南明政權一直保持着良好的關係，直至桂王政權的最後滅亡。

市舶提舉司，簡稱市舶司，是明朝管理海外貿易的機構。明朝政府擔心讓外國商船直接停泊在廣州，會對省會安全構成威脅。於是，在正德年間將市舶司的“泊口”（即外國船隻的停泊港口）由廣州移到電白縣。由於電白縣不是傳統的對外貿易港口，不利於中外貿易的正常往來，東南亞各國商人，於是集結於香山、東莞、新寧縣各澳，而聚於浪白澳者尤多。但浪白澳風高浪大，水土甚惡，難以久駐，而澳門則比較合適。廣東當局遂於1535年（嘉靖十四年）將市舶司泊口遷移至香山境內的濠鏡澳，澳門從此開埠。葡萄牙商人賄賂指揮黃慶（又作黃瓊），得以在澳門沿岸停泊船隻，進行貿易。

1821年（清道光元年），在歐美大陸資產階級革命運動的推動下，葡萄牙的資產階級民主革命運動進入高潮。由公民選舉產生的葡萄牙議會制定了君主立憲的憲法，下達了取消一切封建權利和義務的命令，在葡萄牙民主運動的影響下，澳門的葡萄牙人分成了敵對的兩派：一是以土著葡萄牙人為主體，有着強烈變革要求的立憲派，其首領為巴波沙（Paulino da Silva Barbosa）少校；一是以葡萄牙貴族官員為主體，力圖維護原有特權的保守派，其首領是地方長官亞利鴉架（Miguel Arriaga）。立憲派先是開展請願活動，抗議議事局無視市民的要求，提出恢復原來的議事局政體，免除澳門對果阿、帝汶的財政補貼，任用澳門土生葡萄牙人在當地文職機構及軍隊任職等一系列請求。澳葡當局被迫於1822年2月16日召集市民在市政廳舉行忠於憲法的宣誓。但他們對民眾所要求的改革並不準備實行。在這種形勢下，立憲派與澳葡當局，特別與保守派首領矛盾越來越尖鋭，並不時採取激烈行動，使亞利鴉架的人身安全受到很大的威脅。1822年8月中旬，澳門民主運動爆發。市民若瑟在8月17日議事局開會時，提交了一份由83位市民聯名的抗議書。這份抗議書指控亞利鴉架慫恿中國官員干預澳門事務，以維持自己的地位。亞利鴉架自知受到市民的普遍敵視，表示願意辭職。市議員向市民們宣佈了他辭職的消息，並表示準備進行一次新的選舉。8月19日，市民們舉行選舉大會。會上，立憲派與保守派發生尖鋭的衝突。保守派頭目卡瓦爾坎蒂（Cavalcanti）宣稱，這一會議沒有確定新政體的權力。與會的市民都被激怒，當即將他從窗口扔到街頭。這時，巴波沙登台演説，指出人民希望建立的是與憲法完全符合的政體。會議最後決定，重新恢復1784年（清乾隆四十九年）前的政體，授予新選出的議事局不受總督及地方長官控制的立法權、行政權和司法權。總督只能掌管軍事。亞利鴉架則被剝奪一切職務。9月12日，巴波沙又創辦了澳門有史以來的第一張報紙－《蜜蜂華報》。該報宗旨鼓吹立憲派各項主張，成為新政權的喉舌。澳門資產階級立憲派領導的民主運動進入高潮。被罷免的亞利鴉架並不甘心失敗，煽動總督阿爾布克爾克（Afonso de Albuquerque）發動政變。但很快被立憲派擊敗。1823年，葡印總督派“薩拉曼特拉”號巡洋艦運載一批士兵駛往澳門，旨在恢復舊政權，鎮壓澳門民主運動。由於中國政府的干涉，他們未敢輕舉妄動。9月23日凌晨，士兵在澳門偷偷登陸，沒有遇到任何抵抗，就進抵市政廳前的廣場，並逮捕了立憲派領袖巴波沙。隨後，保守派組織了政府委員會，來攝理總督職權，並將亞利鴉架官復原職。接着，他們大肆鎮壓立憲派，查封《蜜蜂華報》。與此同時，葡萄牙王子米格爾（Dom Miguel）也在本國發動政變，解散議會，廢除憲法，恢復其父若奧六世專制君主的權力。澳門保守派狂熱地歡呼這一場政變，他們宣誓效忠於君主專制政體，舉行了盛大的慶典和宴會。澳門民主運動遂因此而夭折。

1840年（清道光二十年）8月19日，英軍對澳門地區的中國駐軍發動進攻，他們進攻的目標是控制葡萄牙出入的關閘。中午，英軍3艘軍艦和運輸船逼近蓮花莖，向關閘和關閘附近的炮台猛烈開火。守衛關閘內外的軍隊除有近幾個月內進駐的1300人外，還有臨時趕來增援的督標參將波啟善、署肇慶協副將多隆武、署撫標守備程步韓等率領的兩標官兵及升任南澳鎮總兵暫留香山協的惠昌耀指揮的水師，水陸官兵共達2000人左右。面對英軍的攻擊，中國駐軍一齊出動。新授廣東高廉道台暫駐澳門的易中孚率兵從澳門一帶北進，多隆武、波啟善等率兵自北山一帶南進。惠昌耀的水師駛抵青洲海面，隔着蓮花莖向英船開炮。雙方展開激戰，葡萄牙人按兵不動，以示中立。由於英軍在武器技術方面明顯佔有優勢，經過約1小時戰鬥，英軍擊毀關閘的界牆及附近的炮台，擊敗中國軍隊，參將波啟善、守備陳宏光等負傷。接着，300名英印士兵登上蓮花莖，佔領關閘，並升起了英國國旗，還用關閘上的大炮轟擊望廈等處的中國官兵。最後，他們搬走架設在關閘等處的20餘門大炮，堵塞其餘大炮的火門，放火燒毀中國軍隊的棚房，才登船撤離。關閘之役以中國軍隊的失敗而告終。

18世紀80年代葡萄牙王室強化對澳門直接管治權的行為。1784年（清乾隆四十九年），澳葡當局根據葡萄牙殖民大臣卡斯特羅（Martinho do Melo e Castro）的指令（即王室制誥），在澳門進行了一場“政治改革”。主要內容包括：首先是加強總督的權力，總督不僅是作為澳門的軍事首領，而且可以干預當地的日常政務，否決議事局的一切提案，成為澳門的最高首長；其次是解散過去的市政衛隊，組成一支由100名火槍兵和50名炮兵組成的印度兵衛隊，增強澳門的警衛力量；再次是確立由總督和王家法官審計國庫收支，取消議事局代營的制度。

繼西、葡、荷之後，英國成為最強盛的殖民國家。雖然葡、英間早於1661年訂有《梅吐英條約》，但這並未能避免這兩個盟國在歐洲以外的競爭、衝突。英國以履行條約之名，藉口幫助葡人守衛澳門，行圖佔之實。自1600年英國東印度公司成立之後，對葡萄牙人租佔下的澳門覬覦不斷。據統計，從1623年至1840年間曾發生10餘起英人圖佔澳門事件。其中以1808年事件最為嚴重。1807“半島戰爭”中，法軍破里斯本，葡萄牙本土淪陷，王室出逃巴西避難。1808年8月，英印總督援引兩國間的攻守盟約，要求澳督同意英軍進駐澳門，以防法軍的可能進攻。此議遭澳門當時總督花利亞（Bernardo Aleixo de Lemose Faria）拒絕後，英軍強行登陸並佔據砲台多座。

為確定澳門界址舉行的重要談判。1887年（清光緒十三年）的《中葡和好通商條約》訂明，澳門界址未劃定，要俟兩國派員妥為會訂，再行特立專約。1888年底，中葡政府曾舉行劃界談判，未有結果。1909年（清宣統元年），中葡於香港再次會談，中方代表為中法雲南交涉使高而謙，葡方代表為葡屬東非殖民地總督馬沙度。葡方提出將北山嶺、內港、對面山、氹仔、路環及大小橫琴島，總共326平方公里面積歸屬澳門的無理要求，引起廣東和中國內地各界人士的強烈反對。香山、廣州等地以及世界各國僑社均成立勘界維持會，怒斥澳葡侵略行徑。高而謙故意拖延，會談僵持數月。馬沙度提出將澳門問題提交海牙國際法庭裁處，遭清政府拒絕。香港會談於同年11月13日結束，後到北京會談，均無結果。辛亥革命後葡萄牙政府多次照會中國政府要求重開劃界談判，因葡方仍持原有立場，故未重開，澳門界址也一直未被劃定，懸而未決。

19世紀中葉澳葡藉機向清守軍報復並襲擊關閘的事件。1849年（清道光二十九年）的“關閘事件”，是關閘第二次遭受大規模進犯，且是遭受英、葡的水、陸夾攻。此次事件的引發，導火線是極力推行殖民擴張的澳督亞馬留（João Maria Ferreira do Amaral）被望廈龍田村民沈志亮等人刺殺。1849年8月22日，亞馬留被刺殺後，澳葡當局在英、美、法列強支持下，有恃無恐，藉此挑起事端，於8月28日早晨，由炮兵軍曹米士打基打率領100多名正規軍和20名志願軍，攜三門大炮，在快艇炮火支持下，對關閘發動進攻，戰事擴展到拱北北嶺，古關閘城樓被炮火轟毀。駐守關閘汛營的清軍兵力薄弱，由於援兵未到，面對來勢洶洶的葡兵，措手不及，不戰而退，關閘為葡兵佔據。在關閘事件中，葡兵1名重傷，清軍4人死亡，葡兵且將戰死的1名清兵的手臂和1名軍官首級砍下，作為戰利品，掛在竹竿上，帶返澳門，遊街示眾。經此一役，清軍退守前山寨。這是清王朝在澳門的主權地位受到嚴重挑戰的一次重大事件。

特大颱風災害，1874年（清同治十三年）9月22日夜，一次罕見的特大颱風橫掃了澳門地區。港灣內大小船隻紛紛沉沒，岸上的房屋成片倒塌，花王堂受電擊起火，火光衝天，燒毁大量的房屋。據事後統計，在這場重大劫難中，澳門約有5000人死亡，2000艘漁船、貨船沉沒，還有包括花王堂在內的大批建築被摧毁，損失共達200萬元。因這一年是甲戌年，史稱“甲戌風災”。後來，澳葡當局為紀念這一重大自然災難的死難者，定9月22日為“天災節”。

見查封阿巴羅修道院。

英國人司各脱因殺人被清朝地方政府處決一案。1772年（清乾隆三十七年）12月14日，在商船上當舵工的英國人司各脱（Francis Scott），與由他僱請來澳門工作的華人劉亞米鬥毆，劉亞米被司各脱用刀砍傷致死。澳葡當局逮捕、審訊司各脱後，由於他拒不認罪，即認為他無罪，並拒絕把司各脱依法送往香山縣丞衙署受審。廣東當局遂關閉關閘，停止對澳門的糧食供應，澳葡當局被迫交出罪犯。中國官員對司各脱進行審訊，司各脱起初繼續抵賴，後因有人出庭作證，才供認不諱。經廣東大吏覆核，司各脱罪行確鑿。1773年2月23日，廣州知府到澳門與澳葡當局一起處死了司各脱，結束了這一場衝突。居澳的各國人士包括葡人，都進一步認清了當時葡萄牙在澳門的地位，澳門的真正長官，是駐紮澳門的香山縣丞。